Zoptymalizowana metodyka wykrywania bakterii Alicyclobacillus spp. w koncentratach soków owocowych

Badanie przeprowadzono w celu oceny wiarygodności wyników uzyskanych zgodnie z metodą wykrywania IFU nr 12. Metoda filtracji, w porównaniu do metody wzbogacania, zwiększa prawdopodobieństwo wykrycia skażenia Alicyclobacillus zagęszczonych soków owocowych.

Niniejsze badanie zostało przeprowadzone w celu dokonania oceny wiarygodności wyników uzyskanych zgodnie z metodą wykrywania IFU Nr 12. Metoda filtracji, w porównaniu do metody wzbogacania, zwiększała prawdopodobieństwo wykrycia zanieczyszczenia koncentratów soków owocowych bakterią Alicyclobacillus. Metoda wzbogacania przy współczynniku rozcieńczenia wynoszącym 1:10 nie była przydatna podczas wykrywania Alicyclobacillus spp. w koncentratach soków z ciemnych owoców jagodowych. W takim przypadku wymagane jest 50-krotne rozcieńczenie przy użyciu pożywki BAT.

Wprowadzenie

Alicyclobacillus spp. są pojawiającymi się organizmami powodującymi psucie się żywności. Rozwój kilku gatunków bakterii Alicyclobacillus, zwłaszcza A. acidoterrestris, w soku owocowym może spowodować pojawienie się nieprzyjemnego zapachu wskutek wytworzenia się związków takich jak gwajakol (2-metoksyfenol) lub 2,6-dibromofenol i 2,6-dichlorofenol oraz „seropodobnego” zapachu kwasu 3-metylomasłowego oraz kwasu 2-metylomasłowego.

Przetrwalniki Alicyclobacillus są w stanie kiełkować w środowisku kwasowym o pH 2,0-6,0 i wykazują niezmiernie wysoką termoodporność. Wartości D₉₅ (podawany w minutach czas, w którym liczba żywych komórek zmniejsza się o 90 %, w temperaturze 95 °C), które można znaleźć w literaturze, wynosiły 1,85 - 15,1 minut. A zatem, bakterie te mogą przetrwać konwencjonalną pasteryzację i powodować psucie się soków owocowych i innych kwaśnych produktów spożywczych.

Od początku lat 80-tych XX w., kiedy po raz pierwszy udokumentowano zepsucie się soku jabłkowego spowodowane przez termofilne kwasolubne bakterie przetrwalnikujące, opracowano wiele podłoży izolacyjnych i metod identyfikacji.

Międzynarodowa Federacja Producentów Soków Owocowych (International Federation of Fruit Juice Producers - IFU) podjęła się opracowania akceptowalnych międzynarodowo metod wykrywania Alicyclobacillus spp. w koncentratach i sokach, a następnie opublikowała ogólną metodę wykrywania tych organizmów. Metoda ta jest szeroko stosowana w Europie.

Obecność związków hamujących w koncentratach soków owocowych może prowadzić do uzyskania fałszywie ujemnych wyników badań, jeżeli w podłożu występuje wysoki poziom tego typu związków. Zbadano powiązanie pomiędzy stężeniem soku a charakterystyką rozwoju A. acidoterrestris. Zaobserwowano silną korelację z rodzajem soku. 

Niniejsze badanie zostało przeprowadzone w celu dokonania oceny wiarygodności wyników uzyskanych zgodnie z metodą wykrywania IFU Nr 12 dla branży soków owocowych oraz przydatności tej metody w rutynowym stosowaniu.

Materiały i Metody

Przeprowadzono porównanie dwóch metod wykrywania bakterii Alicyclobacillus – metody filtracji i metody wzbogacania. Próbki (10 g) koncentratów soku jabłkowego (67- 73 °Bx) oraz koncentratów soków z ciemnych owoców jagodowych (63-68 °Bx: czarna porzeczka, malina, truskawka, wiśnia, aronia) zostały rozcieńczone w sterylnej dejonizowanej wodzie (1:10) do filtracji membranowej. W metodzie wzbogacania jako rozcieńczalnika użyto sterylnej dejonizowanej wody lub pożywki BAT. Po rozcieńczeniu próbki poddano obróbce termicznej w temperaturze 80 °C ± 1 °C przez 10 min. Po schłodzeniu próbki zostały przefiltrowane przez membranę z porami o wielkości 0,45 pm (Milllpore Corp.). Po przemyciu sterylną dejonizowaną wodą filtry są przenoszone do pożywki BAT agar pH 4,0 (Merck) oraz K agar (peptony, 5,0 g/l, ekstrakt drożdżowy, 2,5 g/l, glukoza, 1 g/l, Tween 80,1 g/l, kwas jabłkowy 25 g/l został dodany po sterylizacji do pH 3,7). Inkubacja wszystkich próbek została przeprowadzona w temperaturze 45 °C przez okres do 5 dni. Po 2 i 5 dniach inkubacji rozpoczęto hodowlę wzbogaconej pożywki na BAT agar oraz K agar. Obecność przetrwalników zbadano przy pomocy mikroskopu z kontrastem fazowym. Potwierdzenie obecności Alicyclobacillus opierało się na zjawisku wytwarzania przetrwalników w kwaśnym środowisku (pH 3,7) oraz niemożności rozwoju w środowisku o neutralnym pH na agarze PCA (Merck).

Wyniki

Wszystkie 496 próbek koncentratów soku jabłkowego, w których obecność Alicyclobacillus spp. wykryto za pomocą filtracji, przebadano przy użyciu metody wzbogacania (Tabela 1). Wykrycie bakterii Alicyclobacillus spp. nastąpiło jedynie w 65 ze 181 próbek (32,4 %), kiedy jako rozcieńczalnika, zgodnie z metodą IFU Nr 12, użyto wody destylowanej (1:10). Kiedy koncentraty soku jabłkowego były rozcieńczane przy użyciu pożywki BAT (1:10), wykrycie następowało w 160 z 315 próbek (30,8 %). Kiedy jako rozcieńczalnika używano pożywki BAT odzysk był większy, lecz w niektórych przypadkach rozwój był ograniczony, co wskazuje na obecność związków hamujących w koncentratach soku jabłkowego. Takie samo zjawisko zaobserwowano, gdy użyto kontrolnych kultur A. acidoterrestris DSM 2498 oraz A. acidocaldarius D5M 446 podczas kontroli jakości w naszym laboratorium (dane niepublikowane).

Pośród próbek koncentratów soków z ciemnych owoców jagodowych (czarna porzeczka, malina, truskawka, wiśnia, aronia) zanieczyszczenie wykryto jedynie przy zastosowaniu metody filtracji, metoda wzbogacania nie dała żadnych rezultatów (Tabela 1), kiedy jako rozcieńczalnika użyto wody destylowanej lub pożywki BAT (1:10). Jednakże, kiedy koncentraty soku z ciemnych owoców jagodowych rozcieńczono przy użyciu pożywki BAT (1:50), detekcja Alicyclobacillus spp. była wyższa i osiągnęła 57,1 %. W niektórych przypadkach wzrost został ograniczony przez związki hamujące. Uzyskane wyniki są zgodne z badaniami, które wykazały, że metoda filtracji daje więcej przypadków wykrycia bakterii Alicyclobacillus w koncentratach soków owocowych zawierających związki hamujące niż metoda posiewu powierzchniowego.

Owoce jagodowe są bogatym źródłem związków bioaktywnych, takich jak fenole i kwasy organiczne, które wykazują aktywność przeciwdrobnoustrojową względem wielu mikroorganizmów, w tym ludzkich patogenów. Wykazano przeciwdrobnoustrojowe działanie jagody i jeżyny wobec patogenów przenoszonych drogą pokarmową, w tym Listeria monocytogenes, Salmonella Typhimurium, Campylobacter jejuni oraz Escherichia coli O157:H7. Udokumentowano przeciwdrobnoustrojowe działanie ośmiu jagód skandynawskich (borówki czernicy, borówki brusznicy, maliny właściwej, truskawki, maliny moroszki, czarnej porzeczki i rokitnika) oraz fenoli w jagodach.

W raporcie tym odkryto, że związku fenolowe, a zwłaszcza ellagitaniny w jagodach, były silnymi inhibitorami przeciw patogenom przenoszonym drogą pokarmową (Staphylococcus aureus, Salmonella Typhimurium). W poprzednim badaniu zaobserwowano aktywność przeciwdrobnoustrojową naturalnego soku z ciemnych owoców jagodowych (czarna porzeczka, malina, truskawka, wiśnia, aronia) względem ośmiu dzikim szczepom Alicyclobacillus acidoterrestris. Po 28 dniach inkubacji w temperaturze 45 °C nie odnotowano rozwoju bakterii A. acidoterrestris w tych sokach.

Członkowie Grupy Roboczej Japońskiego Stowarzyszenia Soków Owocowych (Japan Fruit Juice Association - JFJA) zbadali związek pomiędzy stężeniem soku a charakterystyką rozwoju
A. acidoterrestris.

Zaobserwowano silną korelację z rodzajem soku. Naturalny sok pomarańczowy zazwyczaj dobrze wspomagał rozwój bakterii, jednakże występowała tendencja do całkowitego zahamowania wzrostu, jeśli stężenie soku wynosiło ponad 50-60 %. W przypadku soków o wysokiej zawartości polifenoli, takich jak sok z czerwonych winogron, wykrywanie Alicyclobacillus było trudne nawet wtedy, gdy stężenie soku przekraczało 10-20 %. Współczynnik rozcieńczania zalecany w przygotowanej przez JFJA ujednoliconej metodyce wykrywania termofilnych bakterii kwasolubnych, był 20-50-krotny w przypadku soku z czerwonych winogron, 20-krotny w przypadku soku z białych winogron i grapefruita oraz 10-krotny w przypadku soku jabłkowego, pomarańczowego, marchewkowego, cytrynowego
i brzoskwiniowego. Ponadto, w metodzie wzbogacania, JFJA sugerowała stosowanie pożywki YSG (ekstrakt drożdżowy, skrobia, glukoza) jako rozcieńczalnika. Podczas gdy przy stosowaniu metody IFU Nr 12, do badania koncentratów, współczynnik rozcieńczenia jest 10-krotny, a sterylna woda destylowana/demineralizowana jest akceptowalna, gdyż zapewnia środowisko podobne do środowiska soku będącego produktem końcowym. Tylko w przypadku produktów takich jak roztwór cukru i woda wymagane mogą być dodatkowe źródła azotu lub węgla wspomagające rozwój bakterii. Pożywka BAT lub pożywka YSG mogą dostarczyć tych składników odżywczych, lecz dostarczają one ponadto dodatkowych minerałów niewystępujących zazwyczaj w większości soków.

Wnioski

W badaniu tym przedstawiono przeciwdrobnoustrojowe działanie soków z ciemnych owoców jagodowych (czarna porzeczka, malina, truskawka, wiśnia, aronia) względem bakterii Alicyclobacillus spp.

Metoda filtracji, w porównaniu do metody wzbogacania, zwiększała prawdopodobieństwo wykrycia zanieczyszczenia bakterią Alicyclobacillus koncentratów soków owocowych zawierających związki hamujące.

Metoda wzbogacania, przy współczynniku rozcieńczenia wynoszącym 1:10, nawet przy zastosowaniu pożywki BAT jako rozcieńczalnika, nie była przydatna podczas wykrywania Alicyclobacillus spp. w koncentratach soków z ciemnych owoców jagodowych. W przypadku 50-krotnego rozcieńczenia wymagane jest użycie pożywki BAT.

Ważne linki:

Krajowa Unia Producentrów Soków

International Fruit and Vegetable Juice Association